Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка.

Кислотный гидролиз белка

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии Смесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций. нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

2. Определение аминокислотной последовательности в белке

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни - результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

определение аминокислотного состава изучаемого белка;

аминокислотной последовательности в белке.

Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин . Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS ) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной , третичной и четвертичной структур.

8 . Вторичная структура белка –пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова.регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура.

Вторичная структура образуется только при участии водородных связей между пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.

α-Спираль

пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате?-спираль "стягивается" множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность?-спирали. гидрофильность?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

Спиральная структура - наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.

Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование?-спирали. К ним относят:

пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;

участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания;

участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование?-спирали, например метионин, триптофан

β-Складчатый слой Структура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному "гармошкой" Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.

Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного?-складчатог

9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу ("клубок"). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:

ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина-дисульфидные мостики);

ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;

водородные связи;

гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.

Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно.Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как "структурные мотивы".

Синтез белка происходит на рибосомах в виде первичной структуры, т.е. расположенных в определенном количестве и определенной последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями, образованными карбоксильной и α-аминогруппами соседних аминокислотных остатков Пептидная связь - жесткая, ковалентная, генетически детерминированная.В структурных формулах изображается в виде одинарной связи: ,однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:

Вокруг нее вращение невозможно и все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.

Первичная структура открыта в 1898 году профессором казанского университета Данилевским. В 1913 году Эмилем Фишером были синтезированы первые пептиды.

Такая последовательность аминокислот является уникальной для каждого белка и закреплена генетически. При нарушении процесса синтеза первичной структуры белка на рибосоме могут развиваться различные гететические заболевания. Например, при нарушении двух аминокислот в гемоглобине развивается серповидноклеточная анемия.

Для изучения аминокислотного состава белков пользуются сочетанием (или одним из них) кислотного (НСl), щелочного (Ва(ОН)2) и реже ферментативного гидролиза. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащею примесей, освобождается 20 различных а-аминокислот. Все другие открытые в тканях животных, растений и микроорганизмов аминокислоты (более 300) существуют в природе в свободном состоянии или в виде коротких пептидов или комплексов с другими органическими веществами.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α -углерода, замещен на аминогруппу (-NH2), например: следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков являются а-аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминикарбоновых кислотах может находиться, как увидим ниже, в β, γ, δ, ε -положениях.

9. Вторичная структура белков - α-спирали и β-структуры. Строение и функциональная роль доменов.

Вторичная структура - это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O) группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между остатками цистеина

Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии

Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру - складчатый β-слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно, так и антипараллельно

В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.

Супервторичная структура - это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур: α-спираль - два антипараллельных участка, взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу впадина-выступ) αсα, сверхспирализация α-спирали, (βхβ)-элементы в глобулярных белках, представленные двумя параллельными β-цепями, связанные сегментом х, βαβαβ-элементы, представленные двумя сегментами α-спирали, вставленными между тремя параллельными β-цепями.

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ

К ЗАНЯТИЯМ

ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

для студентов, обучающихся по специальности

Педиатрия

Часть I

Центральным методическим советом

Смоленской государственной медицинской академии

Смоленск

УДК: 612.015.

Рецензенты: доктор медицинских наук, профессор А.С. Соловьёв

доктор медицинских наук, профессор О.В. Молотков

Учебно-методическое пособие для самостоятельной подготовки к занятиям по биологической химии для студентов, обучающихся по специальности Педиатрия.

Часть I / Т.Г. Макаренко, К.А. Магеенкова

Смоленск. СГМА. 2012. - 92 с.

Пособие содержит краткое изложение теоретического материала программы по биохимии, не вошедшего в лекционный курс, тесты для проверки знаний, ситуационные задачи, вопросы для экзаменов. В пособие вошли также профильные вопросы по особенностям обмена веществ у детей. Пособие состоит из двух частей в соответствии с учебным планом для III и IV семестров. Пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности Педиатрия.

Советом ГБОУ ВПО СГМА Росздрава РФ

Темы лекционного курса по биохимии (43 часа)

1. Введение в биохимию.

2. Структурная организация белков.

3. Физико-химические свойства белков.

4. Структура, механизм действия ферментов.

5. Свойства ферментов.

6. Внутримитохондриальное окисление. Энергетический обмен.

7. Внемитохондриальное окисление.

8. Общие пути катаболизма.

9. Анаэробное окисление углеводов.

10. Аэробное окисление углеводов. Глюконеогенез.

11. Пентозо - фосфатный путь.

12. Обмен триацилглицеринов и глицерофосфолипидов

13. Обмен холестерина, сфинголипидов.

14. Взаимосвязь обмена жиров и углеводов. Кетоновые тела.

15. Общие пути обмена аминокислот в тканях.

16. Пути обезвреживания аммиака в тканях.

17. Обмен фенилаланина и тирозина.

18. Обмен пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

19. Биохимия гормонов.

20. Биохимия эритроцитов. Обмен гемопротеидов.

21. Физико - химические свойства крови. Дыхательная функция крови.

22. Свёртывающаяи антисвёртывающая системы крови.

23. Водно - солевой обмен.

Материал для самостоятельной работы студентов

(72 часа внеаудиторной работы)

Пособие предназначено для внеаудиторной самостоятельной работы по биологической химии студентов педиатрического факультета.

Пособие включает краткое изложение материала учебной программы по биологической химии для студентов медицинских вузов, не вошедшего в аудиторный лекционный курс. Для студентов, обучающихся по специальности Педиатрия, приводятся дополнительные сведения об особенностях обмена веществ у детей. Тестовые задания к темам занятий используются для промежуточного и итогового контроля знаний. Обсуждение ситуационных задач предполагается проводить на занятиях при участии преподавателя. В связи с этим комментарии к ситуационным задачам в пособии не приводятся. Пособие содержит перечень экзаменационных вопросов по биохимии.

Тема занятия №1

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ. ГИДРОЛИЗ ПРОСТОГО БЕЛКА. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ

2. Цели самостоятельной работы : расширить представления о структурной организации белков

Усвоить биологические функции белков,

Дополнить сведения о первичной, вторичной, третичной, четвертичной структуре белков,

Ознакомиться с особенностями белкового состава тканей в организме детей,

Сформировать навык использования полученных знаний.

4. Перечень вопросов и заданий для самостоятельной работы

Белки - высокомолекулярные полимерные N-содержащие органические вещества, состоящие из аминокислот, соединённых пептидными связями, и имеющие сложную структурную организацию.

Термин «белки» обусловлен способностью этих соединений давать осадки белого цвета. Название «протеины» произошло от protos (греч.) – первый, важный, и отражает центральную роль этого класса веществ в организме.

Содержание белков в организме человека выше, чем содержание липидов, углеводов. От общей массы тканей (сырой массы) оно составляет 18 – 20%. Преобладание в тканях белков по сравнению с другими веществами выявляется при расчёте содержания белков на сухую массу тканей – 40 – 45%. Содержание белков в различных тканях колеблется в определённом интервале. Наиболее высоко содержание белков в скелетных мышцах (18 – 23% от сырой массы или 80% от сухой массы ткани). Низким содержанием белков отличается жировая ткань (6% сырой массы или 4% сухой массы ткани).

В детском возрасте общее количество белков в организме, их состав иные, чем у взрослых людей. В организме плода общее содержание белков не превышает 10% . У новорожденных оно составляет 10 – 12% массы тела. В период новорожденности наблюдается усиление процессов распада белков для энергетических целей. В силу этого содержание белков временно снижается. В раннем детском возрасте преобладают незрелые растворимые структурные белки. С возрастом усиливается их дифференцировка в зрелые функциональные белки.

Биологические функции белков разнообразны. Они связаны с высокой специфичностью белков, способностью взаимодействовать с различными лигандами, рецепторами, структурами клеток.

· Пластическая (структурная) функция – белки входят в состав всех клеточных структур вместе с нуклеиновыми кислотами, липидами, углеводами.

· Энергетическая - 1 г белков обеспечивает образование около 4 ккал

· Регуляторные функции:

а) ферментативная – более 2 000 белков являются биологическими катализаторами, регулируя скорость химических реакций в организме

б) гормональная – некоторые гормоны, регулирующие биохимические и физиологические процессы в организме, относятся к белкам

в) белки гистоны в составе хроматина регулируют активность генов ДНК

г) внутриклеточный белок кальмодулин регулирует активность различных ферментов

· Защитная (иммунная) функция. Некоторые белки (иммуноглобулины, интерферон, лизоцим) обладают способностью связывать чужеродные для организма вещества.

· Специфические функции:

а) сократительная (белки мышц актин и миозин)

б) фоторецепторная (белок сетчатки родопсин)

в) свёртывание крови (фактор свёртывания крови фибриноген)

г) рецепторная – белки входят в состав клеточных рецепторов

Химический состав белков

Элементарный состав белков достаточно разнообразен. В них содержатся многие химические вещества. Однако обязательными химическими элементами являются углерод (51 – 55%), кислород (21 – 23%), азот (16% - наиболее постоянная величина), водород (6- 7%) и сера (0,5 – 2%)

Аминокислотный состав белков . В состав природных белков входят α аминокислоты, которые отличаются структурой радикала у α- углеродного атома.

Тесты

1. В состав природных белков входят химические элементы: Кальций. Углерод. Хлор. Водород. Натрий. Азот. Калий. Кислород. Сера .

Углерод. Водород. Азот. Кислород. Сера.

3. К существенным изменениям биологических свойств белков ведут замены аминокислот:

Глютамат на аспартат. Глютамат на валин.Триптофан на глютамат. Валин на лейцин. Глицин на аспартат. Фенилаланин на триптофан. Серин на треонин. Глицин на аланин.

4. Об окончании гидролиза белка можно судить:

По растворению осадка денатурированного белка. По исчезновению мутности гидролизата. По положительной биуретовой реакции. По положительной нингидриновой реакции. По отрицательной нингидриновой реакции. По положительной реакции Адамкевича. По отрицательной биуретовой реакции.По результатам формольного титрования.

5. Третичную структуру белка стабилизируют связи:

Гидрофобные . Пептидные. Дисульфидные. Ионные . Водородные.

6. Вторичную структуру белков стабилизируют связи:

Дисульфидные. Пептидные. Ионные. Гидрофобные. Водородные.

7. Полярными функциональными группами белков являются:

Карбоксильные. Метильные. Фенольные. Аминные. Карбонильные. Индольные.

8. В образовании пептидной связи участвуют функциональные группы аминокислот:

Эпсилон-аминные. Альфа - аминные. Бета - карбоксильные. Гамма -карбоксильные. Альфа - карбоксильные. Тиоловые.

9. Основополагающей структурой, т.е. определяющей более высокие уровни структурной организации белка, является:

Первичная. Вторичная. Третичная. Четвертичная.

10. Выраженная видовая специфичность белков с одинаковыми природными биологическими свойствами обусловлена:

Принципиальными различиями в аминокислотном составе. Существенными различиями в молекулярной массе. Особенностями пространственной структуры молекул. При схожести первичных структур отдельными равноценными аминокислотными заменами. При схожести первичных структур отдельными неравноценными аминокислотными заменами. Различиями состава небелковых компонентов.

11. Преимущественно на поверхности белковой молекулы расположены аминокислоты:

Неполярные аминокислоты. Полярные аминокислоты. Обе группы аминокислот. Ни одна из этих групп

12. Преимущественно в глубине белковой молекулы расположены аминокислоты:

Неполярные аминокислоты . Полярные аминокислоты. Ни одна из этих групп. Обе группы аминокислот

13. В формировании 3-ой структуры белка участвуют:

Неполярные аминокислоты. Полярные аминокислоты. Обе группы аминокислот . Ни одна из этих групп

14. Причиной изменения сродства гемоглобина к кислороду является:

Изменение третичной структуры протомеров. Изменение взаиморасположения протомеров. Кооперативные изменения конформации протомеров

15. Верно ли данное положение?

Εпсилон - аминогруппа лизина участвует в образовании пептидной связи

Да. Нет. Верный ответ отсутствует

16. Верно ли данное положение?

Радикалы серина и валина обладают гидрофильными свойствами

Да. Нет. Верный ответ отсутствует

17. Шапероны участвуют главным образом в образовании и поддержании:

Первичной структуры белков. Третичной структуры белков . Вторичной структуры нуклеиновых кислот

20%. 10-12%. 5%

Ситуационные задачи

1. На фрагменте пептида: Тир - Цис - Лей – Вал – Асп - Ала

назовите, радикалы каких аминокислот могут участвовать в образовании связей:

Гидрофобных. Ионных. Дисульфидных

2. На фрагменте пептида: Тир – Цис – Лей – Вал – Асп - Ала

укажите, в образовании каких уровней структурной организации белка участвуют связи, образованные радикалами данных аминокислот

3. В крови студента-африканца, поступившего в клинику с жалобами на одышку, головокружение, учащённое сердцебиение и боли в конечностях, в крови обнаружены эритроциты, имеющие форму серпа.

Объясните причину развития данного заболевания.

4. Гемоглобин представляет собой сложный олигомерный белок гемопротеид. Какие посттрансляционные изменения приводят к формированию функционально активного белка?

Основная

Биохимия. Под ред. Е.С. Северина. 2003. С. 9-28, 31-56.

Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. 2001. С. 7- 25.

А.Я. Николаев Биологическая химия. 2004. С. 16-35,38-43.

О.Д. Кушманова. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. 1983. С. 15-19, 19-24.

Лекционный материал

Дополнительная

Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия. 1990. С. 10-41, 49-59.

Р. Марри и др. «Биохимия человека». М. «Мир». 1993. с. 21-51(1)

Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Учебно-методические пособия «Биохимические особенности детского организма». Смоленск. 2001. 2007.

Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Учебное пособие, рекомендовано УМО «Особенности обмена веществ у новорожденных и грудных детей». Смоленск. 2012.

А.Е. Медведев «Открыта 22-ая генетически кодируемая аминокислота» // Вопр. мед. химии. 2002. № 5 -. с. 432

Тема занятия № 2

ОСАДОЧНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ

2 . Цели самостоятельной работы : расширить знания об основных физико-химических свойствах белков и их прикладном медицинском значении, об использующихся в лабораторной практике методах количественного определения белков в биологических жидкостях

3. Задачи самостоятельной работы:

Уметь оценивать биомедицинское значение основных физико-химических свойств растворов белков,

Ознакомиться с нормой содержания белка в сыворотке крови, с возможными отклонениями и их биохимической трактовкой,

Сформировать навык работы с новой информацией, её анализа, логичного изложения,

В лабораторной практике

Для количественного определения белков используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков.

К ним относятся:

- спектрофотометрические методы , оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

- рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

- нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

- поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

Тесты

1. К колориметрическим методам относятся:

Азотометрический. Спектрофотометрический. Сорбция красителей. Метод Лоури. Биуретовый метод. Рефрактометрический.

2. На способности белков приобретать заряд основаны приёмы их анализа:

Рентгеноструктурный анализ. Электрофорез.Ионообменная хроматография.Потенциометрическое титрование. Рефрактометрия. Ультрацентрифугирование. Колоночная гель-фильтрация.

3. Эффект высаливания белков из растворов связан:

С нарушением вторичной и третичной структур. С разрывом пептидных связей. С потерей белками заряда. С дегидратацией их молекул. С формированием четвертичной структуры.

4. Для наиболее полной экстракции белков из тканей животного происхождения можно использовать жидкости:

Спиртоводную смесь. Ацетон. 10% раствор сульфата аммония. Дистиллированную воду. 10% раствор NaCl.10% раствор KCl.

5. Освободиться от сопутствующих низкомолекулярных веществ, присутствующих при экстрагировании белков, без потери белками нативных свойств можно методами:

Электрофорезом. Диализом.Колоночной гель - фильтрацией. Осаждением белков трихлоруксусной кислотой.

6. Белки с различной молекулярной массой можно разделить приёмами физико-химического анализа:

Диализом. Электрофорезом. Высаливанием. Потенциометрическим титрованием. Колоночной гель - фильтрацией.

7. При физиологических значениях рН среды может приобретать или утрачивать свой заряд аминокислота:

Цистеин. Аргинин. Тирозин. Серин. Гистидин. Треонин.

8. Присутствие глобулинов в растворе можно доказать:

Электрофорезом. Колоночной гель - фильтрацией. Высаливанием при 50% насыщении сульфатом аммония . Высаливанием при 100% насыщении сульфатом аммония. Денатурацией мочевиной.

9. Для эффекта денатурации характерны признаки:

Быстрое образование осадка. Утрата биологической активности. Сохранение биологических свойств. Нарушение первичной структуры белка. Медленное образование осадка. Нарушение вторичной и третичной структуры (конформации). Сохранение конформации.

10. Для эффекта высаливания характерны признаки:

Обратимость эффекта. Утрата биологических свойств. Сохранение биологических свойств. Нарушение конформации белка. Сохранение конформации белка. Быстрое образование осадка.

11. Денатурацию белков вызывают:

Хлорид натрия. Серная кислота. Уксуснокислый свинец. Сернокислый аммоний. Азотнокислое серебро. Сульфосалициловая кислота. Мочевина. Глюкоза.

От градиента потенциала. От молекулярной массы белков. От рН среды. От формы белковых молекул. От особенностей аминокислотного состава белков. От наличия в составе белков простетических групп.

13. С помощью высаливания из смеси белков можно выделить:

Оваальбумин. Гамма-глобулин. Сывороточный альбумин.

14. Растворимость белков в воде придают функциональные группы полипептидных цепей:

Карбоксильные. Метильные. Фенольные. Аминные. Карбонильные. Индольные. Гидроксильные. Тиоловые. Иминные.

15. Наиболее объективные данные о молекулярной массе белков дают физико-химические методы:

Криоскопия. Эбулиоскопия. Рентгеноструктурный анализ.Ультрацентрифугирование. Электронная микроскопия.

16. Для точного определения содержания белка в растворе можно применить оптический эффект:

Преломление лучей света. Эффект светорассеивания. Оптическая активность. Поглощение лучей в УФ части спектра.

17. При проведении гель - фильтрации белков используются:

Различия в величине заряда. Различия в молекулярной массе . Различия в оптических свойствах

18. При электрофорезе белков используются:

Различия по величине заряда. Различия по молекулярной массе . Различия оптических свойств

19. Смесь белков церулоплазмина (мол. масса 151 000, изоэлектрическая точка 4,4) и γ - глобулина (мол. масса 150 000, изоэлектрическая точка 6,3) можно разделить методами:

Электрофореза. Гель - фильтрации. Ионообменной хроматографии

20. Рефрактометрические методы количественного определения белков основаны на эффекте:

Светорассеивания. Светопоглощения. Светопреломления . Вращения плоскости поляризованного света

21. Спектрофотометрические методы количественного определения белков основаны на эффекте:

Светорассеивания. Светопоглощения при определённой длине волны. Светопреломления. Вращения плоскости поляризованного света

22. В изоэлектрической точке молекула белка:

Не диссоциируют. Электронейтральны . Движутся к аноду. Распадаются на полипептиды

23. Белки способны образовывать устойчивые водные раствор благодаря наличию:

Броуновского движения Наличию гидрофобных радикалов. Наличию заряда и гидратной оболочки у молекул белка. Всех перечисленных факторов

Ситуационные задачи

1. Укажите направление движения (к аноду, к катоду или остаются на старте) следующего пептида

Лиз – Гли - Ала - Гли

2. Укажите направление движения (к аноду, к катоду или остаются на старте) следующего пептида

Лиз – Глу – Ала - Гли

3. Укажите направление движения (к аноду, к катоду или остаются на старте) следующего пептида

Глу – Гли – Ала - Гли

4. Сделайте выводы об особенностях аминокислотного состава белка, имеющего изоэлектрическую точку = 4,7

5. Какой заряд в нейтральной среде приобретёт белок, имеющий изоэлектрическую точку =4,7?

Поясните ответ.

6. После высаливания белка сульфатом аммония получен осадок, содержащий изучаемый белок с примесью соли. Как можно отделить белок от соли?

7. Основная и дополнительная литература к теме

Основная

Биохимия. Под ред. Е.С. Северина. 2003. С. 67-74

Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. 2001. С. 29-31

А.Я. Николаев Биологическая химия. 2004. С. 43-60

О.Д. Кушманова. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. 1983. С. 7-15, 28-29.

Лекционный материал

Дополнительная

Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия. 1990. С. 37-41.

Р. Марри и др. «Биохимия человека». М. «Мир». 1993. С. 43-51 (1)

Ю.Е. Вельтищев, М.В. Ермолаев, А.А. Ананенко, Ю.А. Князев. «Обмен веществ у детей». М.: Медицина. 1983. 462 с.

Р.М. Кон, К.С. Рот. Ранняя диагностика болезней обмена веществ. М. «Медицина».- 1986.

Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Учебно-методические пособия «Биохимические особенности детского организма». Смоленск. 2001. 2007

Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Учебно-методическое пособие «Особенности обмена веществ у новорожденных и грудных детей» (Рекомендовано УМО). Смоленск. 2012.

Титов В.Н. Методические аспекты определения содержания общего белка сыворотки крови //Клин. лаб. диагностика, 1995, - .№ 2.С. 15-18

Тема занятия № 3

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ.

ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ

2. Цели самостоятельной работы: закрепить знания о принципах классификации белков, свойствах и особенностях состава основных групп простых и сложных белков

3. Задачи самостоятельной работы:

Рассмотреть принципы классификации белков,

Изучить особенности свойств, химического состава и биологических функций основных групп простых и сложных белков,

Сформировать навык работы с новой информацией, её анализа, логичного изложения,

Сформировать навык использования полученных знаний в учебной и профессиональной деятельности.

4. Перечень вопросов для самостоятельной работы

Классификация белков

Огромное количество белков в организме, многообразие их свойств и биологических функций определяют сложности их систематики.

Предложены классификации белков по структурному, функциональному принципам.

«На сегодняшний день о белках известно слишком много, чтобы удовлетворится старой классификацией, и слишком мало для того, чтобы составить лучшую» - такое определение состояния вопроса о классификации белков остаётся актуальным до настоящего времени.

В практическом отношении достаточно удобна классификация белков, учитывающая особенности их химического состава и физико-химических свойств.

Согласно этой классификации, все белки делят на 2 группы: простые (протеины) и сложные (протеиды.

К протеинам (простым белкам ) относят белки, состоящие только из аминокислот.

Они, в свою очередь, делятся на группы в зависимости от физико-химических свойств и особенностей аминокислотного состава. Выделяют следующие группы простых белков:

· альбумины,

· глобулины,

· протамины,

· гистоны,

· проламины,

· глютелины,

· протеиноиды.

Альбумины – широко распространённая группа белков в тканях организма человека. Они имеют сравнительно невысокую молекулярную массу 50– 70 тыс. дальтон. Альбумины в физиологическом диапазоне рН имеют отрицательный заряд, так как в силу высокого содержания глютаминовой кислоты в их составе находятся в изоэлектрическом состоянии при рН 4,7. Имея невысокую молекулярную массу и выраженный заряд, альбумины перемещаются при электрофорезе с достаточно высокой скоростью. Аминокислотный состав альбуминов разнообразен, они содержат весь набор незаменимых аминокислот. Альбумины – высоко гидрофильные белки. Они растворимы в дистиллированной воде. Вокруг молекулы альбуминов формируется мощная гидратная оболочка, поэтому для высаливания их из растворов необходима высокая 100% концентрация сульфата аммония. Альбумины выполняют в организме структурную, транспортную функцию, участвуют в поддержании физико – химических констант крови.

Глобулины – широко распространённая группа белков, обычно сопутствующая альбуминам. Имеют более высокую, чем альбумины молекулярную массу – около 200 тыс. дальтон, поэтому медленнее перемещаются при электрофорезе. Изоэлектрическая точка глобулинов находится при рН 6,3 – 7. Они отличаются разнообразным набором аминокислот. Глобулины не растворимы в дистиллированной воде, они растворимы в солевых растворах KCl, NaCl в концентрации 5 – 10 %. Глобулины менее гидратированы, чем альбумины, поэтому высаливаются из растворов уже при 50% насыщении сульфатом аммония. Глобулины в организме выполняют структурную, защитную, транспортные функции.

Гистоны – имеют небольшую молекулярную массу 11-24 тыс. дальтон. Они богаты щелочными аминокислотами лизином и аргинином, поэтому находятся в изоэлектрическом состоянии в резко щелочной среде при рН 9,5 – 12. В физиологических условиях гистоны имеют положительный заряд. В различных видах гистонов содержание аргинина и лизина варьирует, в связи с чем, они делятся на 5 классов. Гистоны Н 1 и Н 2 богаты лизином, гистоны Н 3 - аргинином. Молекулы гистонов полярны, очень гидрофильны, поэтому с трудом высаливаются из растворов. В клетках положительно заряженные гистоны, как правило, связаны с отрицательно заряженными ДНК в составе хроматина. Гистоны в хроматине формируют остов, на который накручивается молекула ДНК. Основные функции гистонов – структурная и регуляторная.

Протамины – низкомолекулярные щелочные белки. Молекулярная масса их составляет 4 – 12 тыс. дальтон. Протамины в своём составе содержат до 80% аргинина и лизина. Они содержатся в составе нуклеопротеидов молоки рыб – клупеин (сельдь), скумбрин (скумбрия).

Проламины, глютелины – растительные белки, богатые глютаминовой кислотой (до 43%) и гидрофобными аминокислотами, в частности, пролином (до 10 – 15%). В силу особенностей аминокислотного состава проламины и глютелины не растворимы в воде и солевых растворах, но растворимы в 70% этиловом спирте. Проламины и глютелины являются пищевыми белками злаковых культур, составляя так называемые глютеновые белки. К глютеновым белкам относятся секалин (рожь), глиадин (пшеница), гордеин (ячмень), авенин (овёс). В детском возрасте может наблюдаться непереносимость глютеновых белков, к которым в лимфоидных клетках кишечника вырабатываются антитела. Развивается глютеновая энтеропатия, снижается активность кишечных ферментов. В связи с этим, злаковые отвары детям рекомендуется вводить после 4-х месячного возраста. Не содержат глютеновых белков рис и кукуруза.

Протеиноиды (белковоподобные) - фибриллярные водонерастворимые белки. Входят в состав опорных тканей (костей, хрящей, сухожилий, связок). Они представлены коллагеном, эластином, кератином, фиброином.

Коллаген (рождающий клей) – широко распространённый в организме белок, составляет около трети всех белков организма. Входит в состав костей, хрящей, зубов, сухожилий и др. тканей.

К особенностям аминокислотного состава коллагена относится, прежде всего, высокое содержание глицина (1/3 всех аминокислот), пролина (1/4 всех аминокислот), лейцина. В составе коллагена присутствуют редкие аминокислоты гидроксипролин и гидроксилизин, но отсутствуют циклические аминокислоты.

Полипептидные цепи коллагена содержит около 1000 аминокислот. Различают несколько видов коллагена в зависимости от сочетания в нём различных видов полипептидных цепей. К фибриллообразующим видам коллагена относятся коллаген I типа (преобладает в коже), коллаген II типа (преобладает в хрящах) и коллаген III типа (преобладает в сосудах). У новорожденных детей основная масса коллагена представлена III типом, у взрослых людей – II и I типами.

Вторичная структура коллагена представляет «ломаную» альфа-спираль, в витке которой укладывается 3,3 аминокислоты. Шаг спирали равен 0,29 нм.

Три полипептидные цепи коллагена уложены в виде тройного закрученного каната, фиксированного водородными связями, и образуют структурную единицу коллагенового волокна – тропоколлаген. Тропоколлагеновые структуры размещаются параллельными, смещёнными по длине рядами, фиксированными ковалентными связями, и формируют коллагеновое волокно. В промежутках между тропоколлагеном в костной ткани откладывается кальций. Коллагеновые волокна содержат в своём составе углеводы, которые стабилизируют коллагеновые пучки.

Кератины - белки волос, ногтей. Они не растворимы в растворах солей, кислот, щелочей. В составе кератинов имеется фракция, которая содержит большое количество серосодеоржащих аминокислот (до 7 – 12%), образующих дисульфидные мостики, придающие высокую прочность этим белкам. Молекулярная масса кератинов очень высока, достигает 2 000 000 дальтон. Кератины могут иметь альфа - и бета - структуру. В альфа - кератинах три альфа - спирали объединяются в суперспираль с формированием протофибрилл. Протофибриллы соединяются в профибриллы, затем в макрофибриллы. Примером бета - кератинов является фиброин шёлка.

Эластин – белок эластических волокон, связок, сухожилий. Эластин не растворим в воде, не способен к набуханию. В эластине высока доля глицина, валина, лейцина (до 25 – 30%). Эластин способен растягиваться под действием нагрузки и восстанавливать свои размеры после снятия нагрузки. Эластичность связана с присутствием в эластине большого количества межцепочечных сшивок при участии аминокислоты лизина. Две белковые цепи образуют связь лизил – норлейцин. Четыре белковые цепи образуют связь – десмозин.

К сложным белкам (протеидам ) относят белки, в которых помимо белковой части содержатся небелковые вещества (простетические группы).

Сложные белки классифицируют по химическому составу их простетической группы. Выделяют следующие группы сложных белков:

· хромопротеиды,

· липопротеиды,

· гликопротеиды,

· фосфопротеиды,

· металлопротеиды.

Хромопротеиды содержат в качестве простетической группы окрашенные небелковые соединения. В группе хромопротеидов выделяют гемопротеиды и флавопротеды.

В гемопоротеидах простетической группой является гем – органическое, железосодержащее вещество, придающее белку красный цвет. Гем соединяется с белком глобином за счёт координационных и гидрофобных связей. Примерами гемопротеидов являются белок эритроцитов гемоглобин, белок мышц миоглобин, тканевые белки цитохромы, ферменты каталаза, пероксидаза. Гемопротеиды участвуют в переносе кислорода и в окислительных процессах в тканях.

В флавопротеидах содержится простетическая группа жёлтого цвета. В качестве простетической группы могут быть представлены нуклеотиды ФАД, ФМН. К флавопротеидам относится фермент сукцинатдегидрогеназа. Некоторые флавопротеиды содержат в своём составе металлы – металлофлавопротеиды. Флавопротеиды участвуют в окислительных процессах в организме.

Нуклеопротеиды состоят из белковой части и нуклеиновых кислот: ДНК или РНК. В ядре локализованы дезоксирибонуклеопротеиды, в цитозоле – рибонуклеопротеиды. Белки в нуклепротеидах ядра представлены в основном гистонами. Белковая и небелковая части нуклеопротеидов связаны ионными и гидрофобными связями. При полном гидролизе нуклеопротеидов образуются аминокислоты, фосфорная кислота, углевод и пуриновое или пиримидиновое азотистое основание. Нуклеопротеиды участвуют в хранении и воспроизведении генетической информации.

Липопротеиды в качестве простетической группы содержат различные жиры (триацилглицерины, фосфолипиды, холестерин и др.). Между белком и липидом формируются гидрофобные и ионные связи. Липопротеиды принято делить на структурные, входящие в состав клеточных мембран, и транспортные, осуществляющие перенос жиров кровью. Транспортные липопротеиды представляют собой сферические частицы, внутри которых находятся гидрофобные жиры, а на поверхности – гидрофильные белки. Примером липопротеида может служить фактор свёртывания крови – тромбопластин.

Фосфопротеиды содержат в своём составе остатки фосфорной кислоты, соединённой с серином белковой части сложноэфирными связями. Присоединение фосфорной кислоты к белку носит обратимый характер и сопровождается формированием или разрывом ионных связей фосфорной кислоты и заряженных групп белка, что меняет биологическую активность фосфопротеида. К фосфопротеидам относятся структурные белки костной ткани, казеиноген молока, ововителлин белка куриного яйца, некоторые ферменты (фосфорилаза, гликогенсинтетаза, ТАГ - липаза)

Гликопротеиды содержат, как правило, прочно присоединенные гликозидными связями остатки углеводов (моносахариды, олигосахариды). Гликопротеиды обычно имеют мозаичную структуру, в которой чередуются углеводные и белковые фрагменты. Углеводная часть придаёт специфичность гликопротеидам и определяет их устойчивость к тканевым ферментам. Гликопротеиды широко представлены в организме человека. Они содержатся как в тканях, так и в биологических жидкостях. Муцин слюны содержит в своём составе до 15% маннозы и галактозы. Гликопротеидами являются некот

Содержание Введение 1. Основные компоненты молока 2. Методы анализа аминокислот 1. Хроматографический метод анализа 2. Спектрофотометрический метод анализа 3. Титрометрический метод анализа 4. Электрохимический метод анализа 3.Методы определения аминокислотного состава 1. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии 3.2. Определение аминокислот спектрофотометрическим методом 4. Обзор реферативных журналов Список использованной литературы Введение Проблема питания является одной из важнейших социальных проблем.

Жизнь человека, его здоровье и труд невозможны без полноценной пищи. Согласно теории сбалансированного питания в рационе человека должны содержаться не только белки, жиры и углеводы в необходимом количестве, но и такие вещества, как незаменимые аминокислоты, витамины, минералы в определенных, выгодных для человека пропорциях.

В организации правильного питания первостепенная роль отводится молочным продуктам. Это в полной мере относится к молоку, питательная ценность которого обусловлена высокой концентрацией в нем молочного белка и жира, наличием незаменимых аминокислот, солей кальция и фосфора, так необходимых для нормального развития организма человека. Легкая усвояемость - одно из наиболее важных свойств молока как продукта питания. Более того, молоко стимулирует усвоение питательных веществ других пищевых продуктов.

Молоко вносит разнообразие в питание, улучшает вкус других продуктов, обладает лечебно-профилактическими свойствами. В молоке содержится более 120 различных компонентов, в том числе 20 аминокислот, 64 жирные кислоты, 40 минеральных веществ, 15 витаминов, десятки ферментов и т.д. Энергетическая ценность 1 л сырого молока составляет 2797 кДж. Один Литр молока удовлетворяет суточную потребность взрослого человека в жире, кальции, фосфоре, на 53% - потребность в белке, на 35% - в витаминах А, С и тиамине, на 26% - в энергии. Основная цель данной курсовой работы – выявить аминокислотный состав молока. 1.

Основные компоненты молока

С физико-химических позиций молоко представляет собой сложную полидисп... 5.1). Наибольший удельный вес в молоке занимает вода (более 85%, на остальны... Сухой остаток включает все питательные вещества молока. Он определяет выход готовой продукции при производстве молочных продук...

Хроматографический метод анализа

Одним из наиболее перспективных методов является метод высокоэффективн... Но преимущества метода значительно перекрывают его недостатки. Кроме того, его можно использовать для завершения химического анализа.... На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном экс... Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет количестве...

Титрометрический метод анализа

Титрометрический метод анализа. Из титриметрических методов количественного определения наиболее широк... Титрование может быть проведено с индикатором (кристаллический фиолето... Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков: использование... Для количественного анализа отдельных аминокислот используют также мет...

Электрохимический метод анализа

В последние десятилетия все более широкое распространение получили эле... 3.. в оптимизированных условиях они позволяют определить лишь отдельные ам... Так, разработан способ полярографического определения триптофана, осно... Электрохимический метод анализа.

Методы определения аминокислотного состава

Методы определения аминокислотного состава 3.1.

Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии

В 1 литре дистиллированной воды растворяют 84 г моногидрата лимонной к... 3.2.. Через 10 минут пленку помещают в ХГ камеру с нитратным буфером (буферн... Методика На стартовую линию пластинки наносят 2 (10) мкл гидролизата п... Капли пробы и стандартных аминокислот наносят на стартовую линию на пл...

Определение аминокислот спектрофотометрическим методом

Аминокислоты, первичные амины, полипептиды и пептоны при нагревании с... 0,2 – 3 %-ный раствор нингидрина готовят в разных растворителях (изобу... 2007. к. 2.Цветкова Н.Д.

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Твитнуть

Еще рефераты, курсовые, дипломные работы на эту тему:

Определение энтропии. Определение информационных потерь при передаче сообщений по каналам связи с шумами

Определение сущности БУУ: предмет и метод. Можно дать грубое определение цели УУ: предоставление информации, которая полезна для руководства организации
Буу часть информационной системы предприятия с одной стороны с другой деятельность целями которой является обеспечение информацией руководства.. можно дать грубое определение цели уу предоставление информации которая.. сущность уу заключается в аналитичности информации она собирается группируется идентифицируется и изучается уу..

Данные методические указания предназначены для помощи студентам при выполнении лабораторных работ по описанию и определению минералов и горных пород.. в данных указаниях представлены необходимая терминология и методика описания.. в методических указаниях приведены варианты задания и примеры для выполнения расчетно графических работ по построению..

Имущество предприятия: состав, назначение. Определение потребности в основных и оборотных средствах
Капитал предприятия можно рассматривать с нескольких точек зрения прежде всего целесообразно различать капитал..

Состав преступления позволяет нам отграничить одно от другого.. чтобы обратиться к составу нужно сначала посмотреть основания преступления.. сначала нужно разобраться что такое основания преступления а потом мы увидим что единственное основание это..

Определение энтропии. Определение информационных потерь при передаче сообщений по каналам связи с шумами. Варианты заданий для выполнения
Задание определение энтропии.. сообщение состоит из n символов имеется m типов символов количество букв.. задание определение информационных потерь при передаче сообщений по каналам связи с шумами..

Задания для проведения практических занятий по курсу бухгалтерский учет задание 1. На основании состава имущества оао ростов произвести группировку хозяйственных средств имущества по видам и составу
Учетно экономический факультет.. хахонова н н.. задания для проведения практических занятий..

Основные классы неорганических соединений. Определение молярной массы эквивалентов цинка. Определение теплоты реакции нейтрализации. Скорость химической реакции. Катализ
Введение.. При изучении химии большое значение имеет лабораторный практикум Правильно поставленный эксперимент позволяет..

Интегрированная Среда и Состав языка Object Pascal. Состав языка
Содержание.. Лекция Интегрированная Среда и Состав языка Object Pascal.. Работа с окнами Редактирование в Object Pascal..

Введение в операционные системы. Определение, назначение, состав и функции операционных систем
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования.. тольяттинский государственный университет сервиса..

0.05

Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы.

Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H 2 SO 4). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH) 2 , соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.

Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси.

Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах.

При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге.

Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов.

Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения.

Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.

Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот.

Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.).

Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот.

Ионообменная хроматография . В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.

Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника (катионита, анионита) и на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп.

Для органических ионов на электростатическое взаимодействие с фиксированными зарядами ионита накладывается гидрофобное взаимодействие органической части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание органических ионов и добиться оптимальной селективности их разделения, к водному элюенту добавляют органический компонент (1–25% метанола, изопропанола, ацетонитрила).

В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na + – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком.

Высоковольтный электрофорез на инертных носителях . В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами).

Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.

Аминокислоты несут по крайней мере две слабо ионизированные группы: -СООН и -NH 3 + . В растворе эти группы находятся в двух формах, заряженной и незаряженной, между которыми поддерживается протонное равновесие:

R-COOH ↔ R-COO – + H +

R-NH 3 + ↔ R-NH 2 + H + (сопряженные кислоты и основания)

R-COOH и R-NH 3 + – слабые кислоты, но первая на несколько порядков сильнее. Поэтому чаще всего (плазма крови, межклеточная жидкость рН 7,1–7,4) карбоксильные группы находятся в виде карбоксилатных ионов, аминогруппы протонированы. Аминокилоты в молекулярном (недиссоциированном) виде не существуют ни при каких рН. Примерные значения рК a-аминокислоты и a-аминогруппы в a-аминокислоте равны 2 и 10 соответственно.

Полный (суммарный) заряд (алгебраическая сумма всех положительных и отрицательных зарядов) аминокислоты зависит от рН, т.е. от концентрации протонов в растворе. Заряд аминокислоты можно изменить, варьируя рН. Это облегчает физическое разделение аминокислот, пептидов и белков.

Значение рН при котором суммарный заряд аминокислоты равен нулю и поэтому она не перемещается в постоянном электрическом поле, называется изоэлектрической точкой (pI). Изоэлектрическая точка находится посредине между ближайшими значениями рК диссоциирующих групп.

Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10 –7 –10 –9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о -фталевым диальдегидом.

Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%.

Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.

Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется.

Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2).

В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч.

Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой).

Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды.

При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава.

Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу

	Способ удаления липидов	Весовое соотношение белок: HCl (6М)
Белковые концетнраты (изоляты)	Нетребуется
Мясо, рыба, мясные и рыбные консервы, субпродукты)	Экстракция 10-кратным количеством диэтилового эфира 3–4 раза или смесью этанол-хлороформ (1:2) 10-кратным количеством 2 раза
Молоко и молочные продукты	Экстракция 10-кратным к навеске количеством смесью этанол-хлороформ (1:2) 2 раза
Зерно и зернопродукты	Не требуется
Растительные продукты	Не требуется
Мясо-растительные и рыбо-растительные продукты	Экстракция 10-кратным количеством диэтилового эфира 3-4 раза; смесью этанол-хлороформ (1:2) 10-кратным количеством к навеске 2 раза
Яйцо, яичные продукты	Экстракция смесью этанол- хлороформ (1:2), 10-кратным количеством к навеске 2 раза